Genetik

Alkaptonurie (AKU, OMIM 203500) wird autosomal rezessiv vererbt und betrifft den Phenylalanin- und Tyrosin- Stoffwechsel wie in Abbildung 1 dargestellt (1-7). Dabei wird das Zwischenprodukt Homogentisinsäure (HGA) durch eine Störung des Enzyms Homogentisat 1,2-Dioxygenase (HGD) nicht weiter abgebaut, und es kommt zu einer ca. 2.000-fachen Anreicherung von HGA.  Die Fehlfunktion von HGD beruht entweder auf homozygotischen oder heterozygotischen Mutationen des HGD-Gens (3). Mittlerweile gibt es weltweit mehr als 100 Mutationen, die mit der  komplexen hexameren Proteinstruktur des HGD-Enzymes interferieren und zu einer Inaktivität  des Enzymes führen, auch HGD-Defizienz genannt (1;8-19). Folgen der Alkaptonurie sind: Dunkelfärbung des Urins an der Luft durch die Oxidierung von Homogentisinsäure zu Benzochinonessigsäure, grau-blaue Färbung der Skleren und der Ohrmuscheln (Ochronose) und eine invalidisierende Erkrankung der axialen und peripheren Gelenke (ochronotische Arthropathie), die durch Knorpelabbau verursacht wird (1-4;7;20;21).

 

 

Abbildung 1


Abbildung 1:

Schematische Darstellung des Stoffwechsels von Tyrosin Abbau. Eine Störung des Enzymes Homogentisat-1,2-Dioxygenase verursacht die Erbkrankheit Alkaptonurie durch Anreicherung von Homogentisinsäure (HGA) . Enzyme sind kursiv und blau beschrieben, die entstandenen Metaboliten fett gedruckt.

 

 

 

Homogentisat 1,2 Dioxygenase


Homogentisat 1,2-Dioxygenase (EC. 1.13.11.5, HGD, uniprot Q93099 ) ist eine zytosolische Oxidoreduktase, die hauptsächlich in der Leber, Prostata, Niere, Dünn- und Dickdarm exprimiert wird. Kofaktor  Fe2+ und O2 werden für die katalytische Reaktion um den aromatischen Ring der Homogentisinsäure aufzuspalten benötigt (1;2;4). Diese enzymatische Reaktion besteht aus mehreren Schritten. Zunächst koordiniert das Fe2+ zu der Karbonylgruppe und dem ortho-Phenolsauerstoff der HGA, und anschließend zu His335, His371 und Glu341 der HGD. Danach wird ein Sauerstoffmolekül an das Fe 2+ gebunden, welches dann eine Peroxo-Brücke am aromatischen Ring bildet. Das instabile Intermediat zerfällt, was wiederum zur Öffnung des aromatischen Ringes führt und es entsteht das Endprodukt Maleylacetoacetat (MAA) (22).

 

Das HGD -Gen befindet sich auf Chromosom 3 (3q21-q23) wie in Abbildung 2 dargestellt. Die DNA umfasst 54.363 Basenpaare und besteht aus 14 Exonen, die wiederum eine 1.715 Basen lange mRNA transkriptieren (2;4;23). Das translatierte HGD-Monomer enthält 445 Aminosäuren, hat ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa und wird am N6-Lys98 durch eine Acetylierung post-translational modifiziert (2;24;25). Jedoch ergab die Kristallstruktur der HGD (Pdb: 1EY2) für das bioaktive HGD Enzym eine hexamere Struktur, zusammengesetzt aus einem Dimer zweier Trimerscheiben, die aufeinander gestapelt sind wie in Abbildung 3 illustriert (10). Die Kristallstruktur des HGD-Monomeres mit 2,3 Å ergab zwei Domänen, bestehend aus einer mit 280 Residuen langen N -Terminalen Domäne, die eine zentrale β-Sandwich-Struktur aufweist und von einem β-Faltblatt flankiert wird, welches eine Wechselwirkung mit der  140 Residuen langen C-Terminalen Domäne der benachbarten Untereinheit eingeht (2;10).

 

 

Abbildung 2

 

Abbildung 2:

Chromosom 3 mit Genlocus der Homogentisat 1,2 Dioxygenase (HGD) an 3q21-q23 und der daraus resultierenden HGD Proteinstruktur. Die Koordinaten der HGD Kristallstruktur wurden von Pdb 1EY2 entnommen und mit Chimera 1.5.3 graphisch dargestellt (2;4;10;13).

 

 

 

AKU verursachende  Mutationen des HGD-Enzyms


AKU-Patienten sind entweder homozygot oder compound heterozygot bezüglich Mutationen des HGD-Genes. Diese werden hauptsächlich durch  mehrere sogenannte „hotspots“  im HGD-Gen verursacht, die entweder aus  CCC  bzw. GGG repeats, c.342 + 1 G oder CpG Dinukleotiden bestehen und über das ganze Gen verteilt sind (2;13).  Die meisten der Mutationen (66 %) sind sogenannte „Missense Mutationen“ und verursachen einen Austausch der Aminosäure in der Proteinstruktur. 13 % der Mutationen verursachen ein „alternatives Splicing“ und 12 % einen „Frameshift“, während 7 % der Mutationen in ein Stopcodon resultieren, was wiederum zu einer C-terminalen Trunkierung im Protein führt.  Nur jeweils 1 % aller Mutationen ergeben entweder  eine Expansion oder eine Deletion wie in Abbildung 4 zusammengefasst (13).

 

Ein Grund für die große Anzahl der AKU verursachenden Mutationen liegt in der komplexen Hexamerstruktur des bioaktiven HGD-Enzymes. Kleinste durch eine Mutationen verursachte Veränderung in der Primärstruktur von HGD können verheerende Konformationsänderungen hervorrufen und die Quartärstruktur so beeinträchtigen, dass das Enzym inaktiv wird, was als HGD-Defizienz bezeichnet wird und Alkaptonurie zur Folge hat.  Demzufolge konnten schon mittels Strukturanalysen folgende Mutationen anhand ihrer Einflüsse  auf die Proteinstruktur der HGD gegliedert werden wie in Tabelle 1 zusammengestellt (9;13).

 

 

Abbildung 3

 

Abbildung 3:

Schematische Zusammensetzung der bioaktiven Homogentisat 1,2-Dioxygenase (HGD) mit aktivem Zentrum. Das bioaktive HGD-Enzym besteht aus 6 Untereinheiten, wovon 3 Untereinheiten jeweils eine trimere Scheibe bilden. 2 dieser trimeren Scheiben stapeln sich zu einem Hexamer aufeinander. Somit ist  das HGD Enzym ein Dimer zweier Trimeren. Das aktive Zentrum mit den Residuen His335, His371 und Glu341, die jeweils an das Fe2+ koordinieren, ist im Insert dargestellt.  Die Koordinaten der HGD Untereinheiten,  der Trimeren und des Hexamers wurden aus Pdb: 1EY2-bio entnommen und mit dem Softwareprogramm Chimera 1.5.3 graphisch bearbeitet (9;10).

 

 

Tabelle 1: 

Zusammenfassung der AKU-Mutationen, die mit der Proteinstruktur  der HGD interferieren und zu HGD-Defizienz führen (9;13).

Einfluss der AKU-Mutationen auf die Proteinstruktur

Mutationen

Einfluss auf das aktive Zentrum

Direkte Beeinträchtigung durch Unterbrechung der Liganden-bindung mit dem Kofaktor Fe 2+

H371R, H292R

Indirekte Beeinträchtigung durch Konformationsänderungen

R330S, W97G

Beeinträchtigung des Substratzuganges zum aktiven Zentrum

K57N

Einfluss auf die Tertiärstruktur des HGD Monomeres

Durch Unterbrechung der hydrophobischen Wechselwirkungen

W97G, V300G, V181F, F227S, P230S, P230T

Durch Unterbrechung der elektrostatischen Wechselwirkungen

D153G, K248R

Durch Unterbrechung der Wasserstoffbrücken

S189I

Durch sterische Hinderung

G161R, G270R, G260R

Beeinträchtigung der Quartärstruktur des HGD Trimeres

Durch Unterbrechung der Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Untereinheiten

E42A, E168K, L25P, W60G, Y62C, A122D, M368V

Durch Verlust der Residuen L430und N440, die für die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Untereinheiten wichtig sind.

Stopmutationen mit C-Terminaler Trunkierung als Folge

Beeinträchtigung der Quartärstruktur des HGD-Hexamers

Durch Unterbrechung der Wechselwirkungen zwischen den Trimerscheiben

R225H, I216T, R53W, W322R, D294N

 

 


Eine genetische Datenbank aller weltweit bekannten genetischen hgd Mutationen wurde kürzlich durch Dr. A. Zatkova aus der Slowakei zusammengefasst (Abbildung 4) und ins Internet gestellt (6;18).

 

 

Abbildung 4

 

Abbildung 4:

Zusammenfassung aller von AKU-Patienten identifizierten hgd -Mutationen des HGD-Genes. A, schematische Darstellung der hgd -Mutationen am HGD-Gen. B ,   Prozentuale Verteilung der verschiedenen Punkt-mutationen, die in AKU-Patienten gefunden wurden [Entnommen mit freundlicher Genehmigung von Zatkova , 2011 (13;19)]

 

 

 

Epidemiologie


Die Häufigkeit von AKU beträgt weltweit ca. 1 : 100.000 - 250.000, jedoch gibt es sogenannte Hotspots wie die Slowakei, Jordanien, Indien, Dominikanische Republik und Berlin. Die zahlreichste Prävalenz mit ca. 1 : 19. 000 ist jedoch in der Slowakei zu finden, während in Berlin Häufigkeitsrate von 1 : 31. 000 ermittelt wurde (4;8;9;11;13;16;17;26-34).

 

In der von Dr. Zatkova zusammengefassten Datenbank wurden von den zehn untersuchten deutschen AKU-Patienten vier verschiedene Mutationen identifiziert, wobei M368V mit über 55 % die am häufigsten vorkommende Mutation in Deutschland ist wie in Abbildung 5 dargestellt (13).

 

 

 deutschland_mutations2015_kopie.jpg

 

Abbildung 5:

Darstellung der in Deutschland vorkommenden AKU-Mutanten und deren  prozentuale Verteilung aus der internatonalen Datenbank der hgd -Mutationen von Frau Dr. Zatkova (13).  Die Mutationen wurden in die Kristallstruktur von Pdb: 1EY2  eingebaut und mit dem Softwareprogramm Chimera 1.5.3 graphisch bearbeitet. Pinke Markierungen weisen auf die Mutationen in den hier angezeigten HGD-Monomeren hin (10).

 

 

Abbildung 5 zeigt außerdem, dass die Verteilung der AKU-Mutationen teilweise regional abhängig ist. So konnte zum Beispiel  die Mutationen G270R häufig in der Slowakei, R225H in der Türkei und G131R in Mitteleuropa nachgewiesen werden (siehe Abbildung 6) (4;8;13;16;17).

 

 

Abbildung 6

Abbildung 6: Lokale Häufigkeiten der AKU-Mutationen in der Slowakei (G270R), Türkei (R225H) und Mitteleuropa (G161R) (4).

 

 

Referenzliste

  1. Phornphutkul, C., Introne, W. J., Perry, M. B., Bernardini, I., Murphey, M. D., Fitzpatrick, D. L., Anderson, P. D., Huizing, M., Anikster, Y., Gerber, L. H., and Gahl, W. A. (2002) Natural history of alkaptonuria. N.Engl.J.Med. 347, 2111-2121.
  2. Kayser, M. A., Introne, W., and Gahl, W. A. (2009) Chapter 92: Alkaptonuria. In Vale, D., Beaudet, A. L., Vogelstein, B., Kinzler, K. W., Antonarakis, S. E., Ballabio, A., Scriver, C. R., Sly, W. S., and Childs, B., editors. The Scriver's Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Diseases , McGrawHill Companies, Columbus, 1-30.
  3. Gahl, W.A., Introne, W., Kayser, M., Phornphutkul, C., and Suwannarat, P. (2011 ) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1454/ .
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  5. Timmis, O. (2011 ) http://www.rarediseasesindia.org/aku .
  6. Porfirio, B. (2011 ) http://www.rarediseasecommunities.org/en/community/alkaptonuria-aku/article/orphanet-article-on-aku-2007 .
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  8. Uyguner, O., Goicoechea, d. J., Cefle, A., Baykal, T., Kayserili, H., Cefle, K., Demirkol, M., Yuksel-Apak, M., Rodriguez, d. C., and Wollnik, B. (2003) Molecular analyses of the HGO gene mutations in Turkish alkaptonuria patients suggest that the R58fs mutation originated from central Asia and was spread throughout Europe and Anatolia by human migrations. J.Inherit.Metab Dis. 26, 17-23.
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